L’expérience d’imagerie cérébrale CLARITY – Kwanghun Chung et Karl Deisseroth

L’exploration anatomique et fonctionnelle du système nerveux central a longtemps été tributaire d’un compromis physique en apparence indépassable : la dissociation artificielle entre l’échelle microscopique des interactions moléculaires et l’échelle macroscopique des architectures neuronales. Depuis les travaux pionniers de Santiago Ramón y Cajal et de Camillo Golgi à la fin du dix-neuvième siècle, la compréhension de la connectivité cérébrale reposait fondamentalement sur le découpage du parenchyme en sections ultrafines. Si cette fragmentation mécanique a permis de jeter les bases de la neurobiologie cellulaire, elle a simultanément brisé la continuité tridimensionnelle des axones, fragmenté les arborisations dendritiques et rendu illusoire la cartographie fidèle des circuits polysynaptiques étendus.

Au début des années 2010, les neurosciences ont connu une rupture épistémologique majeure grâce à l’émergence des technologies d’ingénierie tissulaire appliquées à l’optique biomédicale. Parmi ces innovations de rupture, la méthode CLARITY, développée au sein de l’Université Stanford par l’ingénieur chimiste Kwanghun Chung et le neuroscientifique et psychiatre Karl Deisseroth, a redéfini les frontières de l’imagerie volumétrique. En transformant un organe biologique opaque et lipidique en un hybride hydrogel-tissu optiquement transparent et perméable aux macromolécules, CLARITY a levé le verrou séculaire de la diffusion lumineuse tout en préservant l’intégrité spatiale des protéines et des acides nucléiques.

Le présent article propose une analyse approfondie des fondements théoriques, des protocoles physico-chimiques, des modalités de microscopie et des applications biomédicales de la technologie CLARITY. De l’élimination sélective des lipides membranaires par électrophorèse à la cartographie computationnelle des neuropathologies complexes telles que l’autisme, la schizophrénie ou la maladie d’Alzheimer, nous explorerons comment cette méthodologie s’est imposée comme un pilier fondamental de la neuroanatomie moderne, réconciliant la biologie moléculaire avec la topologie globale des réseaux cérébraux.

1. Introduction et genèse historique de la méthode CLARITY

1.1 Les impasses de l’histologie cérébrale traditionnelle

L’histologie cérébrale conventionnelle s’est heurtée pendant plus d’un siècle à une contrainte biophysique élémentaire : l’opacité intrinsèque du tissu nerveux. Cette opacité découle principalement de la forte concentration en lipides membranaires, en particulier la myéline qui entoure les axones, créant une hétérogénéité d’indices de réfraction qui disperse massivement les photons incidents. Pour contourner cette barrière et permettre le passage de la lumière nécessaire à la microscopie optique, les chercheurs devaient impérativement recourir au sectionnement mécanique sériel à l’aide de microtomes, de vibratomes ou d’ultramicrotomes. Le tissu cérébral était ainsi découpé en tranches ultrafines, dont l’épaisseur oscillait typiquement entre 5 et 50 micromètres.

Ce procédé physique invasif engendrait une perte irréversible de continuité anatomique. Les axones longs, capables de projeter sur plusieurs centimètres voire dizaines de centimètres à travers différentes structures cérébrales, étaient inexorablement sectionnés. Lors de la manipulation et de la dépose de ces coupes sur des lames de verre, des contraintes mécaniques asymétriques induisaient inévitablement des déchirures microscopiques, des étirements élastiques différentiels et des replis tissulaires. Lors des tentatives de reconstruction tridimensionnelle assistée par ordinateur, l’alignement des coupes successives — le problème dit du recalage d’images (registration) — devenait un défi mathématique colossal, fréquemment entaché d’erreurs d’interpolation spatiale et d’artefacts géométriques majeurs.

En outre, la pénétration de la lumière dans les tissus biologiques non clarifiés demeure limitée à quelques dizaines de micromètres en microscopie confocale standard, et à moins d’un millimètre en microscopie multiphotonique en raison des phénomènes conjoints de diffusion de Rayleigh et de diffusion de Mie. L’histologie classique obligeait ainsi les neuroscientifiques à choisir arbitrairement entre une résolution subcellulaire restreinte à des volumes microscopiques déconnectés de leur contexte global, et une macroscopie non invasive mais incapable de résoudre la morphologie synaptique ou axonale, à l’instar de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle.

1.2 La rencontre scientifique entre Kwanghun Chung et Karl Deisseroth

C’est précisément pour dépasser cette aporie que s’est nouée, au sein du département de bio-ingénierie de l’Université Stanford, une collaboration décisive entre deux profils scientifiques aux compétences hautement complémentaires. Karl Deisseroth, professeur de psychiatrie et de bio-ingénierie, s’était déjà imposé mondialement comme le pionnier de l’optogénétique, une technologie révolutionnaire permettant de contrôler l’activité de populations neuronales spécifiques au moyen de la lumière et de protéines photosensibles comme la channelrhodopsine. Cependant, Deisseroth se heurtait à une limite méthodologique frustrante : s’il pouvait manipuler et observer l’activité de circuits cérébraux chez l’animal vigile, il demeurait incapable d’analyser a posteriori la connectivité synaptique précise de ces mêmes réseaux à l’échelle de l’organe entier sans détruire le tissu par le tranchage sériel.

L’arrivée au sein de son laboratoire de Kwanghun Chung, jeune chercheur postdoctoral doté d’une solide formation en génie chimique et microfluidique acquise au Georgia Institute of Technology, a catalysé le saut conceptuel attendu. Chung envisagea le cerveau non pas comme un échantillon biologique statique qu’il fallait préserver selon les canons de l’histologie traditionnelle, mais comme un système chimique complexe gouverné par des propriétés de transport de masse, de polymérisation macromoléculaire et de thermodynamique des solutions. La convergence entre l’ambition neurobiologique de Deisseroth — cartographier les fondements structurels des états psychiatriques — et la maîtrise des matériaux polymères de Chung a orienté les recherches vers une approche radicalement hétérodoxe.

Leur objectif partagé était ambitieux et en apparence paradoxal : extraire totalement les composants membranaires responsables de l’opacité — à savoir les lipides — tout en immobilisant rigoureusement dans l’espace tridimensionnel l’ensemble des protéines fonctionnelles, des récepteurs synaptiques et des acides nucléiques. Il ne s’agissait plus simplement de rendre un tissu translucide par déshydratation chimique agressive, mais de construire un échafaudage moléculaire synthétique capable de suppléer l’architecture lipidique native pour soutenir l’intégrité informationnelle du système nerveux.

1.3 La publication fondatrice de 2013 dans la revue Nature

L’aboutissement de ces travaux a été officialisé en avril 2013 par la publication dans la revue Nature d’un article retentissant intitulé « Structural and molecular interrogation of intact biological systems ». Kwanghun Chung y figurait en premier auteur et Karl Deisseroth en auteur senior. L’article introduisait l’acronyme CLARITY pour Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining-compatible Tissue-hYdrogel. Pour la première fois dans l’histoire des sciences biomédicales, les auteurs démontraient la transparisation intégrale et sans découpage mécanique d’un cerveau de souris adulte, révélant un organe parfaitement translucide, semblable à une lentille de verre souple, au travers duquel le texte d’un document sous-jacent pouvait être lu sans distorsion optique majeure.

La communauté neuroscientifique internationale a accueilli cette publication comme une véritable déflagration méthodologique. Contrairement aux approches historiques de transparisation par solvants organiques issues des protocoles de Werner Spalteholz au début du vingtième siècle, CLARITY apportait la preuve que l’extraction des lipides n’impliquait pas la dénaturation thermique ou structurelle des protéines fluorescentes endogènes, comme l’Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP). Les chercheurs démontraient également qu’un cerveau intact pouvait subir de multiples cycles d’hybridation et d’immunomarquage avec des anticorps fluorescents, ouvrant la voie à une interrogation moléculaire itérative et hautement multiplexée.

Validée par les comités de lecture et saluée par les plus éminents spécialistes de la neuroanatomie, la technique CLARITY a immédiatement suscité un engouement planétaire. Elle a redéfini le paradigme de l’observation microscopique en démontrant que l’opacité tissulaire n’était pas une fatalité biologique, mais une simple discordance physico-chimique soluble par l’ingénierie macromoléculaire. Cet événement fondateur a marqué le coup d’envoi d’une décennie d’innovations intenses dans le domaine de la connectomique et de la transparisation tissulaire à grande échelle.

2. Fondements biophysiques et chimiques de la technologie CLARITY

2.1 Le rôle structural et optique des lipides membranaires

Pour appréhender la mécanique intime de CLARITY, il est indispensable d’analyser la nature biophysique de l’opacité tissulaire. Dans le parenchyme cérébral sain, la lumière visible (dont les longueurs d’onde s’étendent approximativement de 400 à 700 nanomètres) subit une diffusion optique multiple extrêmement prononcée. Cette diffusion découle de la disparité structurelle et spatiale entre les indices de réfraction des différents micro-environnements cellulaires. Le cytoplasme aqueux présente un indice de réfraction d’environ 1,33 à 1,37, tandis que les protéines structurales affichent un indice moyen proche de 1,43. Les lipides membranaires, en revanche, possèdent un indice de réfraction particulièrement élevé, oscillant généralement entre 1,44 et 1,48, voire plus pour les structures myélinisées denses.

Les bicouches phospholipidiques, composées d’une tête polaire hydrophile et de chaînes d’acides gras hydrophobes hautement condensées, constituent une interface optique omniprésente à l’échelle nanométrique. Chaque transition d’un photon lumineux à travers une membrane plasmique, une vésicule synaptique ou les enroulements concentriques de la gaine de myéline produit une réfraction et une dispersion selon les lois de Snell-Descartes et la théorie de la diffusion de Mie (les structures diffusantes ayant des dimensions comparables ou supérieures à la longueur d’onde incidente). Ce phénomène convertit rapidement un faisceau incident cohérent et balistique en un halo lumineux diffus, interdisant toute focalisation en profondeur.

Pourtant, d’un point de vue purement informationnel et cytoarchitectural, les lipides ne sont que les conteneurs du système nerveux. L’information biologique fonctionnelle — les neuropeptides, les canaux ioniques, les récepteurs membranaires, les éléments du cytosquelette comme l’actine et la tubuline, ainsi que l’ADN et les ARN — réside dans les macromolécules protéiques et nucléiques. L’enjeu physico-chimique résidait donc dans la dissociation sélective de cette dualité : solubiliser et extraire la totalité des lipides hydrophobes sans altérer, déplacer ou dissoudre le squelette macromoléculaire porteur du signal biologique.

2.2 L’échafaudage synthétique à base d’hydrogel d’acrylamide

La solution magistrale apportée par Kwanghun Chung consiste à substituer au réseau lipidique préexistant un échafaudage artificiel hydrophile formé d’un polymère biocompatible : un hydrogel de polyacrylamide. Le protocole repose sur l’infusion dans le parenchyme cérébral de monomères d’acrylamide associés à un agent réticulant bifonctionnel, le bisacrylamide (N,N’-méthylène-bis-acrylamide), le tout en présence d’un fixateur chimique classique, le paraformaldéhyde (PFA).

Le rôle du formaldéhyde est double et central. Dans un premier temps, il réagit avec les amines primaires des protéines cellulaires et des acides nucléiques via une réaction d’addition nucléophile pour former des intermédiaires instables de type méthylol (hydroxy-méthyle). Ces groupements réactifs condensent ensuite spontanément avec d’autres molécules aminées pour former des ponts méthylène (-CH₂-). De manière cruciale, le formaldéhyde permet également de conjuguer directement les monomères d’acrylamide et de bisacrylamide aux chaînes peptidiques des protéines endogènes. En revanche, les phospholipides — à l’exception notable de rares espèces aminées comme la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylsérine — ne possèdent pas de sites fonctionnels libres susceptibles de réagir avec le formaldéhyde et l’acrylamide dans ces conditions physico-chimiques.

Lors de l’activation thermique ultérieure, catalysée par un amorceur radicalaire spécifique comme le VA-044, une réaction de polymérisation radicalaire en chaîne se déclenche. Les monomères d’acrylamide se lient pour former de longues chaînes carbonées linéaires, entrecroisées par le bisacrylamide pour créer un réseau tridimensionnel poreux et hautement hydraté. Au cours de cette réaction, les protéines et macromolécules préalablement modifiées par l’acrylamide sont incorporées de manière covalente au squelette du gel. L’échantillon devient alors un hybride physico-chimique chimiquement stable : les biomolécules fonctionnelles sont physiquement verrouillées à leur position spatiale native avec une fidélité nanométrique, tandis que les lipides demeurent libres, non polymérisés, piégés uniquement par confinement mécanique dans les mailles de l’hydrogel.

2.3 Homogénéisation de l’indice de réfraction

L’extraction complète des lipides membranaires par détergence — étape que nous détaillerons dans la section suivante — laisse subsister une matrice hybride composée exclusivement du réseau d’hydrogel aqueux et des macromolécules biologiques réticulées. Toutefois, l’extraction lipidique ne suffit pas à conférer au tissu une transparence optique parfaite. En effet, un tissu délipidé immergé dans un tampon salin aqueux standard (comme le PBS, avec un indice de réfraction n ≈ 1,334) demeure opalescent. Cette turbidité résiduelle s’explique par l’écart d’indice persistant entre la solution d’hydratation (eau, n = 1,33) et la charpente macromoléculaire dense constituée de polyacrylamide et de protéines (dont l’indice moyen est d’environ 1,45 à 1,50).

Pour éliminer définitivement toute diffusion résiduelle de la lumière, il est impératif de procéder à une étape d’adaptation d’indice de réfraction (refractive index matching). Cette phase consiste à remplacer l’eau contenue dans les pores du gel par une solution de montage hautement visqueuse et optiquement dense, formulée pour afficher un indice de réfraction précisément calé sur celui de la matrice hybride, c’est-à-dire n = 1,454 à 1,460. Dans leur publication initiale de 2013, Chung et Deisseroth ont préconisé l’usage d’une solution commerciale nommée FocusClear, basée sur un dérivé de diatrizoate de méglumine et d’autres agents hydrosolubles de haute densité optique.

Par la suite, des alternatives biochimiques plus économiques et performantes ont été développées, notamment le milieu RIMS (Refractive Index Matching Solution), formulé à base de Histodenz ou d’iodixanol dilué dans un tampon adapté avec des conservateurs. Lorsque la solution pénètre au cœur de l’échantillon par équilibrage osmotique et diffusion passive, les micro-variations de l’indice de réfraction s’effacent complètement à toutes les échelles d’espace. Les photons incidents ne subissent plus aucune déflexion aux interfaces microscopiques : le tissu cérébral devient optiquement invisible et homogène, permettant un trajet rectiligne de la lumière à travers plusieurs millimètres ou centimètres de matière biologique.

3. Protocole expérimental et étapes opératoires détaillées

3.1 Perfusion transcardique et réticulation de l’hydrogel

La mise en œuvre pratique de la méthode CLARITY débute par une procédure chirurgicale rigoureuse chez l’animal anesthésié en profondeur. Une thoracotomie médiane est pratiquée afin d’exposer le cœur, suivie de l’insertion d’une canule de perfusion dans le ventricule gauche et de l’incision de l’atrium droit pour permettre l’évacuation du système circulatoire. L’animal est d’abord perfusé avec une solution glacée de tampon phosphate salin (PBS) additionné d’héparine pour éliminer la totalité des hématies. Cette étape est cruciale, car l’hème présent dans l’hémoglobine résiduelle constitue un chromophore puissant susceptible d’absorber les photons et de générer une autofluorescence parasite intense lors de l’imagerie.

Immédiatement après le blanchiment des organes, la solution de perfusion est commutée vers un mélange précurseur monomérique d’hydrogel refroidi à 4 °C. La formulation classique comprend 4 % de paraformaldéhyde (p/v), 4 % d’acrylamide (p/v), 0,05 % de bisacrylamide (p/v) et 0,25 % d’un amorceur thermique azoïque hydrosoluble, le VA-044 (chlorhydrate de 2,2′-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]). Le maintien strict d’une basse température est indispensable pour inhiber toute réaction prématurée de polymérisation dans les tubulures et les microvaisseaux cérébraux au cours de la perfusion transcardique.

Une fois le cerveau disséqué avec précaution, il est immergé dans le même cocktail d’hydrogel à 4 °C pendant une période de 48 à 72 heures. Cette phase d’incubation statique permet la diffusion passive complète des petites molécules de monomères à travers l’ensemble du parenchyme cérébral dense. Une fois l’équilibre de diffusion atteint, l’amorce de la réticulation requiert une élévation contrôlée de la température à 37 °C. Toutefois, l’oxygène moléculaire dissous agit comme un puissant inhibiteur des radicaux libres générés par le VA-044. Il est donc obligatoire de désaérer complètement l’échantillon sous vide et de saturer l’atmosphère de l’enceinte de réaction avec un gaz inerte, typiquement de l’azote pur (N₂), avant d’engager le bain-marie thermique pendant environ trois à quatre heures. À l’issue de cette étape, le tissu cérébral est entièrement gélifié au sein d’un bloc viscoélastique translucide dont les excédents périphériques sont minutieusement excisés.

3.2 Extraction lipidique électrophorétique active (ETC)

L’extraction des phospholipides membranaires de la matrice hybride constitue l’étape la plus technique et la plus sensible du protocole CLARITY originel. Les lipides étant insolubles dans l’eau, leur mobilisation nécessite un détergent ionique puissant capable de détruire les bicouches membranaires et d’émulsionner les chaînes aliphatiques hydrophobes. Le dodécylsulfate de sodium (SDS) est utilisé à une concentration de 4 % dans un tampon borate (typiquement 200 mM, pH 8,5). Le SDS s’intercale massivement entre les molécules lipidiques et s’auto-assemble pour former des micelles mixtes chargées négativement à leur surface.

Afin d’accélérer l’élimination de ces volumineuses micelles de détergent-lipide, dont la diffusion passive naturelle à travers les pores serrés de l’hydrogel nécessiterait plusieurs mois pour un organe intact, Chung et Deisseroth ont conçu un système d’extraction tissulaire électrophorétique active (ETC, pour Electrophoretic Tissue Clearing). L’échantillon d’hydrogel est placé dans une chambre électrophorétique sur mesure, équipée d’électrodes en platine inaltérables, et soumis à un gradient de potentiel électrique continu (généralement entre 10 et 40 volts) orienté perpendiculairement à l’axe de l’échantillon.

Sous l’action de la force électromotrice de Lorentz, les micelles de SDS-lipides fortement électronégatives migrent de manière dirigée vers l’anode, traversant les mailles poreuses de la matrice de polyacrylamide sans arracher le squelette protéique covalentement stabilisé. Le dispositif impose un renouvellement dynamique et continu de la solution de tampon borate-SDS via une boucle de circulation fermée intégrant un échangeur thermique. Cette régulation thermique est impérative : le passage d’un courant électrique élevé à travers une solution saline génère par effet Joule une dissipation thermique substantielle qui, si elle n’est pas rigoureusement maintenue entre 37 °C et 45 °C, peut induire la surchauffe du bain, la fusion thermique de l’hydrogel et la dénaturation irréversible des protéines fluorescentes endogènes.

3.3 Clarification passive et sécurisation tissulaire

Bien que l’extraction électrophorétique active permette de clarifier un hémisphère de souris en un temps record de 24 à 48 heures, sa mise en œuvre en laboratoire s’est souvent avérée délicate. Les variations locales de conductivité électrique, les gradients de pH au voisinage des électrodes en platine, la dégradation du SDS ou le colmatage microscopique des flux pouvaient provoquer des arcs électriques microscopiques, des dépôts électrochimiques néfastes ou des brûlures thermiques dévastatrices, détruisant instantanément des spécimens précieux comme des biopsies de tissu humain post-mortem.

Face à ces écueils techniques, une variante simplifiée et largement adoptée — la clarification passive (également connue sous le nom de protocole CLARITY passif ou Passive CLARITY Technique, PACT) — a été formalisée. Dans cette approche sécurisée, le système d’électrophorèse sous haute tension est purement et simplement abandonné au profit d’une extraction thermodynamique douce. L’échantillon réticulé dans un hydrogel chimiquement allégé en monomères est simplement immergé dans un bain tamponné de SDS à 4 % ou 8 %, placé sous agitation constante sur un agitateur orbital à une température régulée de 37 °C à 42 °C.

Ce protocole passif élimine radicalement tout risque d’altération physique, de déformation structurelle ou de destruction par carbonisation de l’échantillon. En contrepartie de cette innocuité absolue, la cinétique de clairance est notablement ralentie, la diffusion micellaire étant régie exclusivement par le premier principe de Fick. Pour obtenir une délipidation complète d’un cerveau murin entier par voie passive, une durée d’incubation oscillant entre deux et quatre semaines est généralement requise, accompagnée de renouvellements périodiques réguliers du bain de détergent saturé. Ce compromis temporel est toutefois largement compensé par une reproductibilité expérimentale considérablement supérieure et une préservation exceptionnelle de la morphologie fine des épines dendritiques et des terminaisons axonales.

4. Immunomarquage moléculaire et interrogation itérative du tissu

4.1 Diffusion d’anticorps dans une matrice hydrogel poreuse

L’un des accomplissements majeurs de CLARITY réside dans sa totale compatibilité avec l’immunohistochimie tridimensionnelle volumétrique. Dans les tissus conventionnels non clarifiés, l’encombrement stérique provoqué par la densité des bicouches phospholipidiques et la compaction des réseaux de collagène et de protéoglycanes empêche la pénétration en profondeur des macromolécules exogènes. Les immunoglobulines G (IgG), dont le poids moléculaire avoisine les 150 kilodaltons pour un rayon hydrodynamique de 5 à 6 nanomètres, ne peuvent pénétrer au-delà de quelques dizaines de micromètres dans un tissu fixé de manière standard.

Dans la matrice CLARITY, l’extraction sélective des lipides ménage des cavités nanoscopiques interconnectées. Le maillage de l’hydrogel d’acrylamide présente une porosité ouverte contrôlée — avec des tailles de pores effectives de l’ordre de 10 à 30 nanomètres — qui autorise la percolation libre des sondes moléculaires. Toutefois, la cinétique de pénétration des anticorps primaires et secondaires dans un volume de tissu de plusieurs millimètres d’épaisseur demeure soumise aux lois de diffusion en milieu encombré (diffusion brownienne ralentie par des interactions transitoires non spécifiques). Le coefficient de diffusion effectif D_eff y est significativement inférieur au coefficient de diffusion libre dans l’eau.

Pour optimiser l’immunomarquage volumétrique et réduire les temps d’incubation, plusieurs paramètres physico-chimiques doivent être finement calibrés. L’augmentation modérée de la température d’incubation (jusqu’à 37 °C), l’ajustement du pH à une valeur légèrement alcaline pour favoriser l’état d’ionisation des épitopes, l’agitation mécanique multidirectionnelle et l’adjonction de faibles concentrations de détergents non ioniques comme le Triton X-100 facilitent la pénétration des immunoglobulines. Le respect rigoureux des étapes de blocage préalable avec du sérum normal permet de neutraliser les sites de fixation non spécifiques au sein de la matrice acrylamide, garantissant ainsi un rapport signal sur bruit optimal même au cœur des structures cérébrales les plus profondes.

4.2 Multiplexage et cycles successifs de marquage

L’architecture purement synthétique et covalente du tissu préparé par CLARITY confère à l’échantillon une résistance mécanique et chimique exceptionnelle face aux traitements dénaturants drastiques. Cette propriété a ouvert la voie à une modalité d’analyse inédite en neurosciences : le multiplexage immunohistochimique itératif ou multi-séquentiel sur un même cerveau intact. Dans les coupes histologiques traditionnelles, l’échantillon est irrémédiablement dégradé lors des tentatives d’élution d’anticorps, limitant le nombre de cibles détectables simultanément aux trois ou quatre canaux spectraux distincts autorisés par la microscopie de fluorescence standard.

Avec CLARITY, une fois la première série d’images volumétriques acquise, les anticorps primaires et secondaires fixés aux antigènes peuvent être spécifiquement élués (processus de destaining ou décoloration chimique). L’échantillon est immergé dans une solution concentrée de SDS (4 %) tamponnée à pH 7,5 ou alcalin, chauffée entre 50 °C et 60 °C pendant quelques heures. Ce traitement perturbe radicalement les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et les forces électrostatiques non covalentes qui maintiennent l’anticorps arrimé à son épitope, provoquant le détachement complet de l’immunoglobuline sans fracturer les ponts covalents carbone-carbone du squelette d’hydrogel.

Après lavage approfondi du détergent, le cerveau clarifié est immédiatement prêt pour un nouveau cycle complet d’immunomarquage ciblant une cohorte entièrement différente de marqueurs phénotypiques ou de neuropeptides. Des équipes de recherche ont ainsi validé jusqu’à cinq ou six cycles successifs de marquage-élution-remarquage sur un même cerveau intact de souris. Cette stratégie permet de cartographier successivement la distribution des neurones glutamatergiques, des sous-populations interneuronales GABAergiques, des cellules gliales (astrocytes, microglie, oligodendrocytes) et des marqueurs de plasticité synaptique, tout en maintenant un référentiel spatial tridimensionnel strictement identique et recalable pixel par pixel.

4.3 Conservation des fluorophores endogènes et hybridation in situ

L’une des percées majeures de CLARITY par rapport aux méthodologies concurrentes de l’époque — telles que le procédé BABB (alcool benzylique / benzoate de benzyle) — repose sur sa biocompatibilité avec les marqueurs fluorescents génétiquement encodés. La structure tridimensionnelle en tonneau bêta (β-barrel) des protéines fluorescentes de la famille de la GFP, de l’YFP (Yellow Fluorescent Protein) ou de la mCherry protège le chromophore central de l’oxydation. Lors de la phase de polymérisation, le paraformaldéhyde conjugue ces protéines à l’hydrogel sans altérer la conformation de leur noyau hydrophobe. Par conséquent, les souris transgéniques exprimant la GFP sous le contrôle de promoteurs spécifiques (par exemple Thy1-EGFP pour le marquage d’une fraction clairsemée de neurones pyramidaux) conservent leur éclat lumineux natif tout au long du processus de délipidation.

Au-delà du signal protéique, la technologie s’est avérée remarquablement polyvalente pour l’analyse des acides nucléiques à l’échelle spatiale. Les molécules d’acide ribonucléique (ARN) messager, stabilisées dans la matrice grâce aux liaisons méthylène induites par le formaldéhyde, restent accessibles pour l’hybridation avec des oligonucléotides complémentaires. La méthode CLARITY s’articule ainsi de façon fluide avec les techniques d’hybridation in situ fluorescente (FISH, pour Fluorescent In Situ Hybridization) et ses variantes amplifiées de pointe comme l’HCR (Hybridization Chain Reaction).

Cette convergence permet d’associer, au sein d’un volume macroscopique inaltéré, la visualisation microscopique de la cytoarchitecture axonale et synaptique d’un neurone avec l’interrogation phénotypique de son profil d’expression transcriptionnelle. Il devient ainsi envisageable de corréler la trajectoire anatomique à longue distance d’un faisceau de fibres nerveuses avec l’expression différentielle d’ARN messagers codant des récepteurs dopaminergiques, des canaux voltage-dépendants ou des facteurs de transcription de lignage cellulaire, conférant à CLARITY une dimension d’histologie moléculaire totale.

5. Systèmes de microscopie optique adaptés aux tissus clarifiés

5.1 Microscopie à feuille de lumière (SPIM / Light-Sheet)

L’obtention d’un cerveau transparent de grand volume soulève un défi physique corollaire : comment imager des millions de voxels microscopiques à travers plusieurs millimètres de profondeur sans détruire le signal par photoblanchiment et sans mobiliser des mois de temps de calcul ? La réponse technologique idéale s’est incarnée dans la microscopie d’illumination planaire orthogonale, communément désignée sous le nom de microscopie à feuille de lumière ou LSFM (Light-Sheet Fluorescence Microscopy) / SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy).

Contrairement aux microscopes conventionnels ou confocaux où l’illumination emprunte le même axe optique que la collection de fluorescence — illuminant en continu l’ensemble du volume conique du spécimen —, la microscopie SPIM découple orthogonalement l’axe d’illumination de l’axe de détection. Une lentille cylindrique génère une nappe lumineuse laser extrêmement fine (dont l’épaisseur au niveau du col de taille oscille généralement entre 2 et 10 micromètres) qui n’excite exclusivement que le plan focal exact observé par l’objectif de collection positionné à 90 degrés. Les fluorophores situés en amont ou en aval de ce plan ne reçoivent aucune énergie lumineuse.

Ce découpage optique pur confère deux avantages colossaux indispensables pour les échantillons CLARITY :

• Une réduction drastique de la photodestruction et du photoblanchiment des fluorophores, autorisant l’imagerie volumétrique répétée ou le balayage haute résolution de structures fragiles.
• Une vitesse d’acquisition ultrarapide grâce à l’utilisation de caméras à transfert de charge ou sCMOS (scientific Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) capables de capturer un plan bidimensionnel complet en une seule exposition de quelques millisecondes, permettant de numériser un cerveau entier de rongeur en seulement quelques heures au lieu de plusieurs semaines.

Cependant, l’utilisation de la microscopie à feuille de lumière sur les tissus CLARITY exige des objectifs d’immersion optique hautement spécialisés. Les lentilles frontales doivent être physiquement et chimiquement inertes face aux solvants de montage de haut indice (RIMS, FocusClear), et le système optique doit être rigoureusement corrigé pour l’indice de réfraction n = 1,454 afin de supprimer les aberrations géométriques de sphéricité qui dégraderaient irrémédiablement le contraste et la résolution axiale.

5.2 Microscopie confocale et multiphotonique en profondeur

Bien que la feuille de lumière domine l’imagerie mésoscopique d’organes entiers, les approches fondées sur la microscopie confocale à balayage laser et la microscopie biphotonique (ou multiphotonique) demeurent des outils d’une précision inégalée pour l’analyse de sous-domaines tissulaires ciblés à très haute résolution spatiale. Dans un tissu non clarifié, la microscopie confocale est strictement limitée par la présence du trou sténopéïque (pinhole) qui rejette la lumière hors foyer mais se trouve rapidement submergé par la diffusion multiple au-delà de 80 micromètres de profondeur.

Une fois le cerveau clarifié par CLARITY, l’absence d’hétérogénéités réfractives permet au faisceau laser confocal de converger en un point de diffraction quasi parfait jusqu’à plusieurs millimètres sous la surface tissulaire. Le pinhole retrouve alors sa pleine efficacité discriminante, garantissant des coupes optiques au contraste exceptionnel sur des blocs macroscopiques d’hydrogel. Toutefois, la nécessité de balayer l’échantillon point par point (galvanométrie) restreint considérablement la surface explorable dans un temps raisonnable, limitant l’usage du confocal aux études ultrastructurales de volumes d’intérêt prédéfinis.

La microscopie biphotonique, exploitant l’absorption non linéaire simultanée de deux photons de basse énergie dans le domaine proche infrarouge (longueurs d’onde de 800 à 1050 nanomètres), constitue un complément remarquable. L’infrarouge traverse les milieux denses avec une diffusion de Rayleigh intrinsèquement plus faible (l’intensité de diffusion étant inversement proportionnelle à la puissance quatrième de la longueur d’onde : I ∝ 1/λ⁴). Combinée à CLARITY, l’imagerie biphotonique permet d’atteindre des pénétrations physiques sans précédent dans le tissu cérébral intact, s’affranchissant totalement des effets d’absorption résiduelle. De surcroît, l’implémentation de miroirs déformables gérés par des dispositifs d’optique adaptative permet de corriger en temps réel les aberrations de front d’onde générées par d’infimes imperfections d’homogénéisation d’indice, restaurant la limite théorique de résolution de diffraction jusqu’aux confins les plus profonds de l’échantillon.

5.3 Résolution spatiale et maintien des échelles nanoscopiques

L’une des inquiétudes légitimes soulevées lors de l’avènement de CLARITY concernait la préservation des structures submicroscopiques. Le traitement par des détergents drastiques, la polymérisation thermique et l’élution lipidique ne risquaient-ils pas d’altérer la géométrie fine des synapses, l’angulation des cous des épines dendritiques ou le diamètre nanométrique des axones amyéliniques ? Les vérifications expérimentales conduites par l’équipe de Karl Deisseroth et confirmées par de multiples consortiums internationaux ont démontré la fidélité architecturale absolue de la méthode.

Des corrélations croisées rigoureuses entre la microscopie optique de tissus CLARITY et la microscopie électronique à transmission (TEM) ont certifié que les densités post-synaptiques (PSD), les échafaudages de récepteurs et les filaments d’actine sous-tendant la tête des épines dendritiques ne subissent aucun collapsus mécanique. L’ancrage covalent des protéines au réseau de polyacrylamide fige la matière avec une précision de localisation inférieure à 5 nanomètres. Cette stabilité structurale a rendu possible l’application directe des méthodologies de microscopie optique à super-résolution — telles que la microscopie STED (Stimulated Emission Depletion) ou la microscopie de localisation de molécule unique (STORM / PALM) — sur des échantillons de tissu clarifié épais.

Grâce à cette alliance technologique, il est devenu possible de naviguer sans discontinuité à travers six ordres de grandeur dimensionnels au sein du même cerveau de mammifère : depuis la vue d’ensemble macroscopique des hémisphères cérébraux (centimètre), en passant par les faisceaux de substance blanche (millimètre) et les circuits cellulaires locaux (micromètre), jusqu’au dénombrement précis des récepteurs des neurotransmetteurs nichés dans la fente synaptique (nanomètre).

6. Cartographie du connectome et neuroanatomie computationnelle

6.1 Traçage axonal sur de longues distances sans discontinuité

L’ambition centrale du Projet Connectome est d’établir le plan de câblage intégral du système nerveux central, reliant chaque classe neuronale à ses cibles synaptiques effectives. Avant l’avènement de CLARITY, le traçage axonal longue distance représentait l’une des tâches les plus fastidieuses et les plus vulnérables de la neuroanatomie. Les axones individuels — dont le diamètre n’excède souvent pas 200 à 500 nanomètres — serpentent à travers des géométries tridimensionnelles extrêmement enchevêtrées, franchissant la commissure antérieure, le corps calleux ou le faisceau télencéphalique médian sur des distances colossales rapportées à leur échelle transversale.

Sur des séries de coupes physiques microscopiques, la moindre erreur de coupe, l’étirement d’un feuillet de tissu ou une perte locale de substance blanche interrompait irrémédiablement la continuité optique de la fibre suivie. Les chercheurs devaient alors recourir à des algorithmes de reconstruction statistique pour tenter d’apparier les extrémités sectionnées de part et d’autre de chaque coupe successive, un processus mathématiquement probabiliste et soumis à un risque permanent d’erreur d’aiguillage entre deux axones voisins.

CLARITY a éliminé de facto la nécessité d’interpoler le tracé des fibres nerveuses. Dans un cerveau transparent non découpé, l’axone d’un neurone pyramidal cortical ou d’une cellule striatale peut être tracé de manière continue, déterministe et ininterrompue depuis son soma d’origine jusqu’à sa cible terminale située dans le tronc cérébral ou la moelle épinière. En outre, cette continuité volumétrique permet de cartographier de manière exhaustive l’ensemble des branches collatérales de l’axone. Elle révèle comment un unique axone peut se ramifier pour innerver simultanément de multiples structures anatomiquement distinctes (comme le thalamus, le striatum et le colliculus supérieur), dévoilant une complexité de divergence synaptique insoupçonnée jusqu’alors.

6.2 Identification des microcircuits et populations d’interneurones

Au-delà des grands axes de projection de la substance blanche, CLARITY s’est imposé comme un instrument d’analyse indispensable pour disséquer la micro-architecture locale du neuropile, en particulier le réseau hautement diversifié des interneurones GABAergiques. Ces neurones inhibiteurs locaux — qu’il s’agisse des cellules en panier exprimant la parvalbumine (PV+), des cellules à somatostatine (SST+) ou des neurones exprimant le peptide vasoactif intestinal (VIP+) — régulent finement la dynamique computationnelle, le gain synaptique et les oscillations gamma des circuits corticaux.

La topologie tridimensionnelle des arborisations axonales d’un interneurone dicte sa fonction biologique exacte. Par exemple, les cellules en chandelier (chandelier cells) étendent des complexes terminaux verticaux caractéristiques (les cartouches) ciblant sélectivement le segment initial de l’axone des cellules pyramidales pour y exercer un contrôle inhibiteur puissant. Dans des coupes histologiques minces, ces structures d’inhibition spécifique sont tronquées et deviennent indistinctes du reste du réseau d’arborisation. Grâce à la préservation intégrale de la géométrie locale offerte par CLARITY, il devient possible de caractériser mathématiquement l’orientation spatiale de ces cartouches, leur distribution spatiale autour de multiples somas neuronaux voisins, ainsi que le nombre exact de boutons synaptiques établis par unité de volume de parenchyme.

De surcroît, la possibilité de coupler cette observation volumétrique avec des marqueurs moléculaires multiples permet d’identifier sans ambiguïté les cibles cellulaires de chaque population d’interneurones. Les chercheurs peuvent quantifier la connectivité réciproque, cartographier les micro-domaines synaptiques excitateurs et inhibiteurs le long des arbres dendritiques, et reconstruire in silico des unités de traitement cortical (telles que les colonnes corticales) en s’appuyant sur des mesures morphométriques réelles et non plus sur des extrapolations théoriques.

6.3 Cartographie globale des réseaux cérébraux entiers

L’intégration de CLARITY dans les flux de travail de neuroanatomie computationnelle a accéléré le passage d’une vision descriptive et localisée du cerveau à une vision holistique et intégrée du connectome global. Les données brutes issues de l’imagerie volumétrique de cerveaux entiers sont désormais recalées sur des atlas stéréotaxiques numériques de référence, tels que l’Atlas de connectivité neuronale de l’Institut Allen (Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework, CCF).

Cette standardisation spatiale globale permet de quantifier rigoureusement, chez des cohortes entières d’animaux soumis à des paradigmes comportementaux ou porteurs de mutations génétiques ciblées, les variations anatomiques fines dans la densité de câblage inter-régional. L’analyse ne se limite plus à la morphologie d’une cellule isolée : elle embrasse la matrice de connectivité globale liant le cortex préfrontal, l’amygdale, l’hippocampe et les ganglions de la base. Les neuroscientifiques computationnels exploitent les outils mathématiques issus de la théorie des graphes — calcul des coefficients de clustering, longueur caractéristique du trajet, modularité, identification des nœuds centraux (hubs) — directement calibrés sur les trajectoires réelles mesurées dans les cerveaux clarifiés.

Cette transformation paradigmatique comble le fossé conceptuel qui séparait la macro-anatomie clinique (accessible par IRM de diffusion) et la micro-anatomie ultrastructurale. Elle offre un substrat physique vérifiable pour les modèles informatiques simulant l’émergence des fonctions cognitives supérieures et le traitement de l’information distribuée à travers le manteau cortical.

7. Applications directes en psychopathologie et psychiatrie biologique

7.1 Neurobiologie structurelle des troubles du spectre de l’autisme

En tant que psychiatre de formation, Karl Deisseroth a immédiatement cherché à appliquer la technologie CLARITY à l’exploration des anomalies structurales sous-jacentes aux troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques, à commencer par les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dans l’article inaugural de Nature en 2013, l’équipe de Stanford a présenté une étude saisissante menée sur des blocs de cortex cérébral post-mortem issus d’un jeune patient atteint d’une forme sévère d’autisme, comparativement à un témoin neurotypique.

L’examen volumétrique tridimensionnel par CLARITY a révélé une architecture dendritique et axonale profondément remaniée au sein du cortex préfrontal dorso-latéral. Alors que le tissu témoin présentait une organisation laminaire régulière avec des prolongements dendritiques apicaux orientés de manière orthogonale et parallèle vers la surface corticale, le tissu du patient autiste a mis en évidence un enchevêtrement aberrant de fibres. Les dendrites présentaient une désorientation spatiale marquée, formant des boucles locales anarchiques et des interconnexions récurrentes en forme d’échelons (ladder-like structures) entre dendrites proximales de la même couche corticale.

Ces observations directes ont apporté un soutien structural tangible à l’hypothèse physiopathologique de l’autisme formulée en termes de dysfonctionnement du rapport excitation/inhibition locale (modèle E/I). L’excès de connectivité locale à courte distance — piégeant l’activité neuronale dans des boucles de rétroaction réverbérantes au détriment de l’établissement de projections à longue distance vers les régions sous-corticales et associatives — a pu être directement visualisé pour la première fois avec une résolution synaptique au sein d’un volume de tissu humain pathologique intact.

7.2 Analyse morphologique des réseaux neuronaux dans la dépression majeure

La dépression majeure unipolaire et les pathologies anxieuses chroniques ont longtemps été associées à des altérations neurobiologiques fonctionnelles, en particulier un déficit de la transmission monoaminergique et une atrophie progressive de structures télencéphaliques comme l’hippocampe et le cortex préfrontal médian. Grâce à CLARITY, les chercheurs ont pu ausculter les soubassements anatomiques de ces altérations dans des modèles murins de stress chronique imprévisible ou de défaite sociale.

L’imagerie volumétrique 3D a permis de visualiser avec une clarté sans précédent le phénomène d’atrophie dendritique et de perte synaptique (élagage excessif des épines dendritiques). Chez l’animal stressé, CLARITY permet de cartographier de façon unifiée la rétraction spatiale des touffes dendritiques distales des neurones pyramidaux CA3 de l’hippocampe, tout en mesurant la baisse drastique de densité des épines champignon (mushroom spines) — substrat structural de la mémoire synaptique à long terme. Simultanément, la méthode a permis de suivre la morphologie globale des réseaux axonaux dopaminergiques issus de l’aire tegmentale ventrale (VTA) et des axones sérotoninergiques issus des noyaux du raphé.

De façon remarquable, les protocoles de CLARITY ont également servi à évaluer les mécanismes thérapeutiques d’agents antidépresseurs à action rapide, à l’instar de la kétamine ou de nouveaux psychédéliques comme la psilocybine. Les analyses d’imagerie volumétrique ont révélé que l’administration d’une dose sub-anesthésique de kétamine induit, en moins de 24 heures, une néo-synaptogenèse spectaculaire visible sous la forme d’un réensemencement massif d’épines dendritiques le long des branches dénudées du cortex préfrontal, validant l’hypothèse d’une restauration anatomique rapide des circuits de la récompense et de la régulation émotionnelle.

7.3 Désorganisation des microcircuits dans la schizophrénie

La schizophrénie est désormais conceptuellement définie comme un trouble de la connectivité neurale fonctionnelle et structurelle (dysconnectivity hypothesis), caractérisé par un déficit substantiel du neuropile sans perte neuronale majeure au niveau des somas. L’investigation de cette hypothèse s’est longtemps heurtée au manque de technologies capables de quantifier la volumétrie fine du neuropile à travers de multiples couches corticales sans introduire d’artefacts de volume liés à la déshydratation des coupes histologiques classiques.

Grâce à CLARITY, des équipes de recherche spécialisées en psychopathologie moléculaire ont pu analyser la cytoarchitecture du cortex frontal de spécimens humains post-mortem et de modèles génétiques murins de schizophrénie (notamment les modèles de microdélétion 22q11.2 ou de mutation du gène DISC1). Les reconstructions tridimensionnelles ont démontré un déficit volumétrique direct de l’arborisation distale des interneurones rapides exprimant la parvalbumine. Les axones de ces neurones présentaient une perte significative de ramification terminale et une diminution de l’expression des transporteurs vésiculaires du GABA (VGAT), compromettant leur capacité à coordonner les décharges synchrones des neurones pyramidaux principaux.

Cette désorganisation volumétrique fine des microcircuits corticaux rend compte de la genèse des altérations cognitives — telles que les perturbations de la mémoire de travail et la dissociation de la pensée — observées cliniquement. CLARITY permet ainsi de franchir un cap déterminant : dépasser les descriptions post-mortem macroscopiques floues pour identifier précisément la vulnérabilité spatiale des nœuds synaptiques au sein de microcircuits fonctionnels définis.

8. Étude des maladies neurodégénératives et lésions cérébrales

8.1 Maladie d’Alzheimer et pathologie des dépôts amyloïdes

La maladie d’Alzheimer est pathognomonique de deux lésions protéiques majeures : l’accumulation extracellulaire de peptides bêta-amyloïdes sous forme de plaques séniles et l’agrégation intracellulaire de protéines tau hyperphosphorylées formant les dégénérescences neurofibrillaires (DNF). Pendant des décennies, ces anomalies ont été documentées sur des coupes microscopiques minces, offrant une vision planaire statique et bidimensionnelle qui occultait la dynamique volumétrique de la pathologie et son impact sur l’environnement cellulaire environnant.

L’application de CLARITY à des cerveaux de souris modèles transgéniques d’Alzheimer (tels que les lignées APP/PS1 ou 5xFAD) ainsi qu’à des tissus corticaux humains a totalement révolutionné cette compréhension spatiale :

• Morphologie et distribution des plaques amyloïdes : CLARITY révèle que les dépôts d’amyloïde-β ne sont pas de simples disques sphériques isolés, mais forment des agrégats complexes, dotés de projections dendritiques filamenteuses irrégulières qui s’infiltrent dans le neuropile le long des axes axonaux majeurs.
• Corrélation neurovasculaire : L’imagerie volumétrique simultanée des microvaisseaux cérébraux (marqués par la lectine ou le collagène IV) a mis en évidence l’existence d’angiopathies amyloïdes cérébrales où les dépôts s’agglomèrent sous forme de manchons cylindriques continus le long de la paroi vasculaire externe, provoquant des sténoses micro-vasculaires et une rupture locale de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique.
• Réaction gliale péri-plaque : La transparisation tissulaire permet de quantifier en trois dimensions le recrutement chimiotactique des cellules microgliales et astrocytaires. Les astrocytes réactifs forment des couronnes denses et tridimensionnelles isolant physiquement les plaques, mais dont les prolongements distaux rétractés cessent de soutenir métaboliquement les synapses périphériques.

De même, le déploiement spatial des filaments de protéine tau anormale a pu être retracé dans les réseaux axonaux corticaux et hippocampiques, confirmant au plan volumétrique l’hypothèse de la propagation trans-synaptique de type « prion-like » de la pathologie tauique le long des voies de connectivité anatomique fonctionnelle.

8.2 Maladie de Parkinson et perte dopaminergique striatale

La maladie de Parkinson se caractérise par la dégénérescence sélective et progressive des neurones dopaminergiques localisés dans la substance noire pars compacta (SNc), dont les projections ascendantes innervent massivement le noyau caudé et le putamen (le striatum dorsal). L’un des écueils majeurs dans l’évaluation des thérapies régénératives ou neuroprotectrices résidait dans l’incapacité d’apprécier quantitativement l’arborisation globale de ces axones dopaminergiques : un unique neurone de la substance noire chez le rongeur possède un champ d’arborisation striatale colossal estimé à plus d’un demi-mètre de longueur cumulée.

Grâce à CLARITY, il est désormais possible de visualiser dans un cerveau entier la trajectoire complète du faisceau nigrostrié et d’évaluer la densité axonale résiduelle par immunomarquage volumétrique de la tyrosine hydroxylase (TH). Lors de modèles expérimentaux de parkinsonisme induits par injection de neurotoxines (comme le MPTP ou la 6-hydroxydopamine), CLARITY permet de cartographier la dégénérescence rétrograde graduelle depuis les terminaisons striatales jusqu’au corps cellulaire somatique, révélant que le dysfonctionnement axonal distal précède largement la mort neuronale par apoptose.

Par ailleurs, l’étude des corps de Lewy — agrégats protéiques pathologiques constitués d’alpha-synucléine phosphorylée — bénéficie grandement de la technologie. L’imagerie volumétrique permet de localiser ces inclusions intraneuronales au sein des volumes cérébraux humains intacts, de caractériser leur impact mécanique sur les organites intracellulaires et d’évaluer l’efficacité de protocoles de thérapie génique visant à restaurer la synthèse de dopamine ou à freiner l’agrégation de l’alpha-synucléine via des vecteurs viraux adéno-associés (AAV).

8.3 Neuro-inflammation et réponses immunitaires intracérébrales

Le système nerveux central, jadis considéré comme un sanctuaire immunologique totalement isolé de la périphérie, est le siège d’interactions immunitaires intenses et dynamiques lors d’accidents vasculaires cérébraux (AVC), de traumatismes crâniens ou de pathologies auto-immunes comme la sclérose en plaques. La compréhension de ces processus pathologiques dépend de l’aptitude à suivre la migration cellulaire à l’interface entre le système vasculaire et le parenchyme cérébral.

La technique CLARITY excelle dans l’analyse de ces micro-environnements inflammatoires tridimensionnels. Elle permet notamment la reconstruction morphométrique intégrale des cellules microgliales résidentes (via des marqueurs tels que Iba1 ou CX3CR1). À l’état physiologique de repos, la microglie arbore un réseau dense et intriqué de prolongements filiformes hautement ramifiés qui scrutent en permanence le neuropile. Lors d’une agression aiguë, telle qu’une ischémie focale, CLARITY capture la transformation morphologique globale de ces cellules en un phénotype amiboïde réactif, dépourvu de branches, ainsi que leur migration polarisée vers le cœur de la zone infarcie.

De surcroît, la transparisation volumétrique permet de suivre avec une précision chirurgicale l’extravasation et la diapédèse des leucocytes circulants (lymphocytes T CD4+/CD8+, neutrophiles) à travers l’endothélium de la microcirculation cérébrale. L’intégrité spatiale préservée permet de délimiter avec exactitude les voies d’entrée privilégiées par les cellules immunitaires, notamment le long des espaces périvasculaires de Virchow-Robin et des structures méningées, éclairant d’un jour nouveau les mécanismes moléculaires qui orchestrent la neuro-inflammation aiguë et chronique.

9. Défis bio-informatiques et gestion des mégadonnées d’imagerie

9.1 Explosion des volumes de données et stockage massif

Si la méthode CLARITY a fait sauter les verrous physiques de l’optique et de l’histologie, elle a simultanément déplacé le goulot d’étranglement de la recherche neuroscientifique vers le domaine de l’ingénierie bio-informatique et du traitement des mégadonnées (big data). L’acquisition à haute résolution microscopique d’un cerveau de mammifère clarifié génère des volumes de données brutes vertigineux qui défient les infrastructures informatiques standards de la plupart des laboratoires de recherche.

À titre d’exemple, l’imagerie volumétrique d’un cerveau murin adulte (dont le volume avoisine 0,5 centimètre cube), réalisée à l’aide d’un microscope à feuille de lumière avec une résolution spatiale isotrope submicronique (voxels de 0,5 × 0,5 × 1,0 micromètre) et sur trois ou quatre canaux spectraux distincts, produit une cohorte de données brutes oscillant généralement entre 5 et 15 téraoctets (To). Pour un cerveau de primate non humain ou un bloc de cerveau humain de taille centimétrique, les jeux de données dépassent couramment plusieurs dizaines, voire centaines de téraoctets.

Ce déluge numérique impose des architectures matérielles de calcul intensif (HPC), des grappes de processeurs graphiques (GPU) et des réseaux de stockage à très haute vitesse (SAN / NAS avec connectivité 100 Gbps). En outre, la communauté a dû élaborer de nouveaux formats de fichiers hiérarchiques et compressés multi-échelles — tels que les formats HDF5, Zarr, ou les structures OME-TIFF — intégrant des pyramides d’images volumétriques. Ces formats permettent le rendu graphique dynamique et la navigation interactive à distance sans saturation de la mémoire vive (RAM), à l’instar des solutions logicielles spécialisées comme BigDataViewer, Imaris, ou Neuroglancer.

9.2 Algorithmes de recalage d’images et reconstruction 3D

L’assemblage d’un volume cérébral complet implique l’acquisition d’une multitude de colonnes de balayage ou de pavés d’images (tiles) tridimensionnels adjacents qui doivent être combinés mathématiquement avec une précision sub-pixellaire : c’est l’étape de couture spatiale (stitching). En raison d’infimes dérives thermomécaniques de la platine du microscope et des distorsions géométriques résiduelles induites par les aberrations sphériques de lentille, la simple juxtaposition des coordonnées cartésiennes de la platine produit des discontinuités axonales visibles.

Les algorithmes de recalage d’images volumétriques opèrent donc par des calculs de corrélation croisée de phase, de maximisation d’information mutuelle ou d’extraction de descripteurs invariants d’échelle (SIFT tridimensionnels) sur les zones de chevauchement entre pavés. Cette étape permet d’éliminer les artefacts de couture et de reconstruire une matrice volumétrique continue et spatialement cohérente.

La seconde phase algorithmique majeure réside dans le recalage non linéaire de ce volume reconstruit sur un atlas stéréotaxique standardisé (par exemple l’atlas de l’Institut Allen). Les algorithmes de déformation élastique de type Diffeomorphic Demons ou les frameworks d’optimisation non linéaire comme ANTs (Advanced Normalization Tools) et elastix appliquent des transformations différentiables et inversibles pour adapter la géométrie de chaque cerveau individuel au modèle de référence. Cette standardisation est la condition sine qua non pour réaliser des analyses de morphométrie voxel par voxel et comparer quantitativement les phénotypes neuroanatomiques entre groupes expérimentaux distincts.

9.3 Segmentation automatisée par intelligence artificielle

Une fois les gigaoctets d’images 3D assemblés et recalés, l’extraction de l’information biologique — identification des milliards d’arborisations axonales, comptage des dizaines de millions de corps cellulaires somatiques, mesure des contacts synaptiques — ne peut plus être accomplie manuellement par l’expérimentateur humain. La conversion des volumes de pixels en graphes mathématiques de connectivité repose intégralement sur des approches computationnelles propulsées par l’apprentissage profond (deep learning).

Les réseaux de neurones convolutifs (CNN) tridimensionnels, et plus particulièrement les architectures dérivées des réseaux U-Net (3D U-Net, V-Net) ou des réseaux d’attention récurrents, ont transformé la segmentation d’images en neurosciences :

• Détection somatique : Les modèles sont entraînés à reconnaître la signature spatiale d’intensité et la morphologie nucléaire pour identifier et dénombrer automatiquement les somas cellulaires avec une précision surpassant 98 % de concordance avec l’annotation humaine.
• Traçage axonal automatisé : L’extraction des trajectoires de neurites individuels intriqués dans des zones de haute densité représente le problème computationnel le plus ardu. Les algorithmes de segmentation par flood-filling (Flood-Filling Networks) développés initialement pour la connectomique électronique sont progressivement adaptés à la microscopie optique de CLARITY pour suivre les chemins continus de neurites le long de gradients probabilistes.

Néanmoins, le taux d’erreur résiduel (faux branchements, sauts de synapses, discontinuités locales dues à une fluctuation locale de fluorescence) demeure un défi central. Les stratégies actuelles privilégient des architectures hybrides mêlant pré-segmentation automatisée par intelligence artificielle et protocoles de correction itérative semi-supervisée (human-in-the-loop) pour valider mathématiquement la topologie des microcircuits les plus denses.

10. Analyse comparative : CLARITY face aux autres méthodes de transparisation

10.1 Méthodes basées sur les solvants organiques (BABB, 3DISCO, iDISCO)

L’émergence de CLARITY s’est inscrite dans un contexte d’effervescence technologique globale qui a vu éclore plusieurs familles concurrentes de transparisation tissulaire. Parmi elles, les techniques fondées sur l’emploi de solvants organiques — initiées dès 1914 par Werner Spalteholz avec le mélange de benzoate de benzyle et de salicylate de méthyle, puis modernisées avec le BABB, 3DISCO, et plus récemment iDISCO — reposent sur un mécanisme physico-chimique radicalement différent.

Ces protocoles procèdent à une déshydratation absolue et forcée du tissu cérébral par des séries de bains d’alcools (éthanol, méthanol) ou de tétrahydrofurane (THF), suivie de l’extraction des lipides par immersion dans des solvants apolaires puissants comme le dichlorométhane (DCM) ou l’éther dibenzylique (DBE). L’indice de réfraction du tissu déshydraté s’élève naturellement aux alentours de 1,56, concordant parfaitement avec l’indice du solvant d’immersion final. La transparence obtenue est d’une rapidité remarquable (quelques jours) et d’une clarté optique exceptionnelle.

Cependant, les solvants organiques présentent des désavantages majeurs face à CLARITY :

• Extinction de la fluorescence : La déshydratation alcoolique et l’environnement hydrophobe dénaturent rapidement la structure des protéines fluorescentes natives (EGFP, EYFP), dont le signal lumineux s’éteint souvent en quelques heures ou jours, obligeant au recours systématique à un immunomarquage exogène de réamplification.
• Rétraction tissulaire : L’extraction de l’eau entraîne une rétraction volumétrique massive du tissu (pouvant atteindre 30 à 50 % du volume initial), modifiant substantiellement les rapports de distance nanoscopiques et les morphologies membranaires fines.
• Toxicité chimique : Les solvants tels que le dibenzyl éther ou le benzène sont des composés hautement volatils, corrosifs et toxiques, imposant des contraintes opératoires sévères et risquant d’endommager les optiques de microscopie spécialisées.

10.2 Méthodes basées sur l’immersion aqueuse et les sucres (Scale, SeeDB)

À l’opposé des solvants organiques, une seconde catégorie de protocoles de transparisation privilégie des approches d’immersion aqueuse hautement sécurisées et bio-préservatrices. Des méthodes telles que Scale (développée par Hiroshi Hama et Atsushi Miyawaki au RIKEN, basée sur une formulation d’urée, de glycérol et de détergent) ou SeeDB (conçue par Meng-Tsen Ke et Takeshi Imai, reposant sur des gradients saturés de fructose et d’eau) ont cherché à adapter l’indice de réfraction sans altérer l’hydratation native du tissu.

Ces méthodes aqueuses partagent un avantage incontestable sur CLARITY : leur remarquable simplicité opératoire. Elles ne requièrent aucune polymérisation d’hydrogel synthétique, aucune chambre d’électrophorèse sous tension et aucun rinçage complexe. Les protéines fluorescentes endogènes conservent leur brillance native de façon quasiment indéfinie au sein de ces matrices douces. De plus, la méthode SeeDB préserve rigoureusement la taille macroscopique et le volume du cerveau sans provoquer de gonflement ni de rétraction spatiale mesurable.

Néanmoins, leurs limitations intrinsèques sont sévères. Ne procédant pas à une extraction complète et active des lipides membranaires (qui demeurent confinés dans le tissu), le niveau de transparence optique maximal atteint par immersion dans le fructose ou le sorbitol demeure modéré. L’imagerie en profondeur à travers plusieurs millimètres souffre d’une absorption et d’une diffusion résiduelles significatives. Plus critique encore : l’absence d’extraction lipidique interdit l’accès aux macromolécules exogènes, rendant l’immunomarquage volumétrique en profondeur avec des anticorps impossible au-delà de 100 à 200 micromètres, confinant ces approches à l’observation de souris transgéniques déjà pourvues d’un marquage fluorescent endogène dense.

10.3 Méthodes par élution de détergents sans polymère (CUBIC)

Une troisième voie a été magistralement explorée par le consortium japonais dirigé par Hiroki Ueda avec la technologie CUBIC (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). CUBIC a cherché à concilier les avantages de la délipidation poussée — propre à CLARITY — avec la simplicité opérationnelle des approches d’immersion aqueuse, en s’affranchissant du recours à un hydrogel polymérisé.

Le protocole CUBIC met en œuvre un cocktail aqueux raffiné associant des amino-alcools (comme la N-butyldiéthanolamine), des détergents non ioniques (Triton X-100) et des molécules dépliantes de protéines comme l’urée. Cette formulation élue massivement et sélectivement les phospholipides membranaires par simple immersion dans des bains incubés à 37 °C sous agitation, suivie d’une étape de montage dans une solution hydrophile dense adaptée en indice (à base d’antipyrine ou de nicotinamide). La méthode permet d’obtenir un degré de transparisation équivalent à celui de CLARITY tout en simplifiant grandement la chaîne opératoire.

Toutefois, l’élimination exhaustive des lipides membranaires en l’absence de l’échafaudage synthétique d’hydrogel — marqueur distinctif de CLARITY — fragilise structurellement le tissu biologique. Le parenchyme délipidé selon le protocole CUBIC subit un ramollissement mécanique extrême et devient particulièrement gélatineux et friable, ce qui rend complexes les manipulations itératives, les transferts répétés et les multiples cycles de lavage-élution d’anticorps. CLARITY conserve ainsi une supériorité mécanique indéniable lorsqu’il s’agit de soumettre des tissus mous ou des biopsies humaines pathologiques fragiles à des analyses immunohistochimiques successives à haute résolution spatiale.

11. Évolutions techniques, variantes dérivées et optimisations

11.1 PACT, PARS et Bone CLARITY : adaptations de la formulation

Dans les années qui ont suivi la publication originelle de Chung et Deisseroth, la communauté scientifique a développé des ramifications méthodologiques pour pallier les limitations initiales de CLARITY et élargir son champ d’application anatomique. Au sein du laboratoire de Viviana Gradinaru au Caltech (California Institute of Technology), plusieurs variantes majeures ont vu le jour, sous les appellations PACT et PARS.

La technologie PACT (Passive CLARITY Technique) a redéfini la composition de l’hydrogel initial. En éliminant l’acrylamide monomérique concentré et en réduisant la teneur en bisacrylamide, l’équipe de Gradinaru a mis au point un hydrogel à maillage plus lâche (souvent constitué de seulement 4 % d’acrylamide sans bisacrylamide externe, s’appuyant uniquement sur les ponts formaldéhyde tissulaires). Cet allègement structurel accroît considérablement le diamètre effectif des pores de la matrice, facilitant une extraction lipidique passive ultra-sécurisée et accélérant la diffusion ultérieure des anticorps d’un facteur trois à cinq.

Simultanément a été développée la méthode PARS (Perfusion-assisted Agent Release in Situ). Au lieu de disséquer le cerveau avant de le plonger dans des bains statiques, PARS exploite le réseau cardiovasculaire intact de l’organisme comme un système d’irrigation microfluidique naturel. Des pompes péristaltiques perfusent en continu les réactifs d’hydrogel, les agents d’amorçage thermique, puis les solutions de SDS à travers la vasculature coronarienne et cérébrale de l’animal. Cette approche permet de clarifier de façon automatisée non seulement le système nerveux central complet, mais des organes entiers périphériques in situ (moelle épinière, rein, cœur, poumons).

Enfin, le protocole Bone CLARITY a résolu le problème réputé insurmontable de la transparisation des tissus osseux et des articulations. En incorporant des étapes répétées de décalcification douce à l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) au protocole PACT, il est devenu possible de rendre l’os temporal, le fémur ou la boîte crânienne totalement transparents, permettant la cartographie directe des niches hématopoïétiques de la moelle osseuse et des terminaisons nerveuses innervant le périoste sans aucun découpage mécanique.

11.2 SHIELD et MAP : sécurisation physico-chimique avancée

Poursuivant ses recherches au Massachusetts Institute of Technology (MIT), Kwanghun Chung a continué de perfectionner la chimie des biomatériaux appliqués à l’histologie en développant le procédé SHIELD (Stabilization to Harsh conditions via Intramolecular Epoxide Linkages to Prevent Degradation), publié en 2019. Alors que CLARITY classique stabilise principalement les structures primaires en liant les monomères d’acrylamide aux résidus aminés, SHIELD introduit un réactif polyépoxyde flexible — le polyglycérol polyglycidyl éther — capable de former des liaisons intra- et inter-moléculaires réticulées stables avec les amines, les carboxyles, les thiols et les phénols.

Cette chimiodiversité de fixation permet de préserver rigoureusement la structure tertiaire et l’activité enzymatique des protéines cibles, conférant aux tissus une résistance exceptionnelle face aux agressions dénaturantes extrêmes (températures atteignant 70 °C, solvants purs, variations drastiques de pH). Les fluorophores endogènes fixés par SHIELD conservent leur état excitable avec une robustesse incomparable, même après de multiples lavages drastiques destinés à l’élution d’anticorps.

Parallèlement, la convergence entre CLARITY et les technologies d’expansion tissulaire microscopique (ExM), développées au MIT par Edward Boyden, a donné naissance au protocole MAP (Magnified Analysis of the Proteome). Dans cette configuration, le tissu délipidé est hybridé non plus avec un hydrogel standard de polyacrylamide, mais avec un gel de polyacrylate hautement absorbant et polyélectrolytique (similaire aux super-absorbants utilisés dans les couches industrielles). Lors d’une étape ultérieure d’hydratation dans l’eau désionisée pure, les mailles du polymère se dilatent de façon uniforme et isotrope d’un facteur 4 à 5 dans toutes les dimensions de l’espace.

La structure anatomique globale et l’espacement entre macromolécules sont physiquement agrandis d’un facteur 64 à 125 en volume :

• Les distances nanoscopiques sub-synaptiques de 50 nanomètres se retrouvent matériellement espacées de 200 à 250 nanomètres.
• Ces détails deviennent directement discernables avec un microscope optique standard à diffraction limitée, sans nécessiter d’instrumentation de super-résolution coûteuse.

11.3 Application au tissu cérébral humain post-mortem

L’adaptation de CLARITY au cerveau humain post-mortem a constitué un impératif éthique et scientifique, mais s’est heurtée à des obstacles biochimiques bien plus redoutables que ceux rencontrés chez les rongeurs de laboratoire. Contrairement aux modèles expérimentaux fixés dans des conditions idéales par perfusion transcardique standardisée, le tissu humain post-mortem provient d’autopsies soumises à un délai post-mortem variable (souvent de 6 à 36 heures), et subit fréquemment une fixation prolongée dans le formol du commerce non tamponné pendant plusieurs mois ou années.

Cette fixation prolongée induit une réticulation hyper-dense, asymétrique et imperméable qui inhibe la diffusion des sondes d’imagerie. De surcroît, le cerveau humain âgé présente une concentration spectaculaire en lipofuscine, un pigment d’usure autofluorescent composé de résidus d’oxydation lipidique et protéique non dégradables, confiné dans les lysosomes neuronaux. En microscopie de fluorescence, la lipofuscine génère une émission parasite extrêmement puissante sur l’ensemble du spectre visible, masquant totalement les signaux spécifiques des anticorps.

Pour surmonter ces difficultés, les protocoles modernes de clarification du tissu humain intègrent des étapes biochimiques spécifiques :

• L’immersion dans des bains de borohydrure de sodium (NaBH₄) ou de glycine pour réduire les ponts aldéhydes libres et désactiver les bases de Schiff responsables de la luminescence non spécifique.
• L’incorporation de traitements chimiques d’extinction de l’autofluorescence au noir Soudan B (Sudan Black B) ou à l’aide de quenchers commerciaux à base de dérivés porphyriniques (comme le TrueBlack).
• L’application de solutions de démasquage épitopique thermique sous pression (heat-induced epitope retrieval, HIER) directement adaptées aux blocs d’hydrogel pour réactiver l’immunogénicité des protéines figées dans le formaldéhyde.

Ces adaptations de pointe permettent désormais la création de biobanques de tissus cérébraux humains intacts, offrant la perspective inédite de cartographier la neuropathologie fine d’échantillons conservés depuis des décennies avec une rigueur analytique égale à celle des modèles murins d’ingénierie génétique.

12. Impact paradigmatique sur les neurosciences et perspectives futures

12.1 Convergence entre CLARITY, optogénétique et électrophysiologie

L’héritage scientifique le plus puissant de CLARITY réside dans sa capacité à parachever la triangulation méthodologique moderne des neurosciences des systèmes, orchestrant la convergence parfaite entre l’électrophysiologie, l’optogénétique et la morphométrie structurale. Historiquement, un chercheur pouvait enregistrer in vivo la décharge de potentiels d’action au sein d’un groupe neuronal (corrélation d’activité), ou stimuler sélectivement une classe cellulaire par la lumière pour induire un comportement moteur ou émotionnel précis (démonstration de causalité). Cependant, le substrat anatomique unitaire liant ces cellules stimulées au reste du connectome demeurait inaccessible au sein du même individu biologique.

Grâce à CLARITY, cette rupture est définitivement comblée par ce que Karl Deisseroth qualifie de bouclage expérimental complet (closed-loop anatomical phenotyping). L’expérimentateur peut exprimer une opsine activatrice couplée à un fluorophore dans une région cérébrale fonctionnelle, enregistrer l’animal en tâche comportementale, puis prélever immédiatement son cerveau pour le soumettre à la délipidation et à la transparisation optique sans altération géométrique.

L’analyse microscopique tridimensionnelle permet alors de retracer l’histoire anatomique exacte de l’expérience :

• Localisation ultrastructurale des fibres optiques d’implantation et des trajectoires des microélectrodes dans le tissu cérébral intact.
• Identification exacte des neurones photostimulés et vérification du niveau d’expression de la channelrhodopsine sur leurs membranes somato-dendritiques.
• Cartographie intégrale et continue des projections de ces mêmes neurones à travers l’encéphale, reliant causalement une signature électrophysiologique, un comportement mesuré et un réseau physique de connectivité synaptique.

12.2 Intégration de la transcriptomique spatiale à grande échelle

L’une des frontières les plus excitantes de la méthode réside dans sa fusion avec les approches de transcriptomique spatiale et d’imagerie génomique in situ. Alors que le séquençage d’ARN sur cellule unique (single-cell RNA-seq) a permis de classifier la diversité taxonomique des neurones en centaines de sous-types distincts selon leur profil d’expression génétique, il présente l’inconvénient rédhibitoire de détruire le tissu, perdant ainsi toute trace de l’emplacement anatomique et de la morphologie cellulaire originelle.

La technologie CLARITY, couplée à des protocoles de séquençage in situ multiplexé comme STARmap (Spatially-resolved Transcript Amplicon Readout mapping) ou MERFISH (Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization), contourne cet écueil. L’hydrogel de polyacrylamide stabilise physiquement les amplicons d’ARN messagers au sein même du soma cellulaire intact. Des cycles enzymatiques successifs de polymérisation, d’hybridation de sondes fluorescentes et de détection optique permettent de séquencer directement in situ les transcrits de centaines, voire de milliers de gènes distincts au cœur d’un volume de tissu clarifié.

Cette hybridation technologique inaugure l’ère de l’anatomie transcriptomique tridimensionnelle : chaque neurone cartographié dans un volume intact de cortex ou d’amygdale n’est plus seulement défini par ses coordonnées stéréotaxiques et ses projections axonales, mais se voit instantanément attribuer son identité moléculaire complète (son « barcode » d’ARN), transformant la neuroanatomie descriptive en une biologie quantitative intégrée des systèmes vivants.

12.3 Transformations conceptuelles dans la compréhension de l’esprit

Sur le plan épistémologique et conceptuel, la méthode CLARITY — et la révolution de la biologie des tissus intacts qu’elle a inaugurée — a profondément modifié notre regard sur la machinerie cérébrale et, par extension, sur la genèse des états mentaux et des pathologies psychiatriques. Pendant des siècles, la pensée médicale a oscillé entre deux extrêmes réductionnistes : d’une part, le localisationnisme strict issu de la phrénologie du dix-neuvième siècle, postulant que chaque fonction psychique réside dans un « centre » cérébral délimité ; d’autre part, l’holisme diffus, envisageant le cortex comme une masse équipotentielle non différenciée.

En rendant le cerveau transparent et en autorisant la navigation sans discontinuité à travers toutes les échelles d’organisation biologique — de la molécule individuelle au réseau global des hémisphères —, CLARITY a scellé le triomphe de la connectomique réticulaire. L’esprit humain et ses altérations pathologiques ne peuvent être réduits ni à un déséquilibre électrochimique amorphe de neurotransmetteurs (la fameuse « théorie chimique » de la dépression aujourd’hui dépassée), ni à la lésion focale d’une structure fermée sur elle-même. Ils procèdent de dynamiques spatiotemporelles émergentes, contraintes et canalisées par une géométrie topologique d’une sophistication colossale.

L’héritage intellectuel des travaux de Kwanghun Chung et de Karl Deisseroth s’inscrit ainsi dans la droite ligne de la tradition anatomique de Ramón y Cajal, tout en transcendant définitivement les limites mécaniques qui avaient entravé ses continuateurs pendant un siècle. En rendant visible l’invisible, CLARITY a doté les sciences contemporaines d’une nouvelle lentille pour sonder la matière biologique la plus complexe de l’univers connu : le système nerveux central, ouvrant des horizons thérapeutiques et conceptuels dont nous ne faisons aujourd’hui qu’entrevoir l’incommensurable portée.

Références

• Chung, K., & Deisseroth, K. (2013). CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods, 10(6), 508-513. https://doi.org/10.1038/nmeth.2481
• Chung, K., Wallace, J., Kim, S. Y., Kalyanasundaram, S., Andalman, A. S., Davidson, T. J., Mirzabekov, J. J., Zalocusky, K. A., Mattis, J., Denisin, A. K., Pak, S., Bernstein, H., Ramakrishnan, C., Grosenick, L., Gradinaru, V., & Deisseroth, K. (2013). Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 497(7449), 332-337. https://doi.org/10.1038/nature12107
• Deisseroth, K. (2014). Circuit dynamics of adaptive and maladaptive behaviour. Nature, 505(7483), 309-317. https://doi.org/10.1038/nature12982
• Gradinaru, V., Treweek, J., Overton, K., & Deisseroth, K. (2018). Hydrogel-tissue chemistry: Principles and applications. Annual Review of Biophysics, 47, 355-376. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-070317-032905
• Hama, H., Kurokawa, H., Kawano, H., Ando, R., Shimogori, T., Noda, H., Fukami, K., Sakaue-Sawano, A., & Miyawaki, A. (2011). Scale: A chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent-mouse brain. Nature Neuroscience, 14(11), 1481-1488. https://doi.org/10.1038/nn.2928
• Ke, M. T., Fujimoto, S., & Imai, T. (2013). SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience, 16(8), 1154-1161. https://doi.org/10.1038/nn.3447
• Park, Y. G., Sohn, C. H., Chen, R., McCue, M., Yun, D. H., Drummond, G. T., Ku, T., Evans, N. B., Oak, H. C., Trieu, W., Choi, H., Jin, X., Lilascharoen, V., Wang, J., Murakami, M. C., Frosch, M. P., Lim, B. K., & Chung, K. (2019). Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional epoxides. Nature Biotechnology, 37(1), 73-83. https://doi.org/10.1038/nbt.4281
• Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., & Tessier-Lavigne, M. (2014). iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell, 159(4), 896-910. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.010
• Susu-man, S., & Keller, P. J. (2015). High-resolution imaging of cleared tissues with light-sheet microscopy. Nature Methods, 12(11), 1022-1031. https://doi.org/10.1038/nmeth.3634
• Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Kishino, F., Tawara, T., Watanabe, T. M., Yokoyama, C., Onoe, H., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Abe, T., Kiyonari, H., Shimizu, Y., Miyawaki, A., Yokota, H., & Ueda, H. R. (2014). Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell, 157(3), 726-739. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.03.042
• Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., & Deisseroth, K. (2014). Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols, 9(7), 1682-1697. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.123
• Yang, B., Treweek, J. B., Kulkarni, R. P., Deverman, B. E., Chen, C. K., Lubeck, E., Shah, S., Cai, L., & Gradinaru, V. (2014). Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell, 158(4), 945-958. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.07.017